A-9小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞系
A-9小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞系源于 C3H 小鼠皮下疏松結(jié)締組織，是經(jīng)化學(xué)誘變得到的胸苷激酶（TK）缺陷型成纖維細(xì)胞模型，在基因互補(bǔ)、輻射敏感性及嘧啶代謝研究中地位關(guān)鍵，其代謝缺陷使其成為 HAT 選擇系統(tǒng)的經(jīng)典工具，為細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供可靠支撐。
該細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞形態(tài)，長(zhǎng)梭形或星形，貼壁生長(zhǎng)呈放射狀排列，長(zhǎng)徑 25-40μm，核橢圓形含 1-2 個(gè)核仁，核分裂象較少。電鏡下胞質(zhì)富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微絲束，與野生型無顯著差異。免疫表型上，vimentin 和 fibronectin 陽性率超 95%，不表達(dá)上皮和內(nèi)皮標(biāo)志物，流式檢測(cè)為 40 條染色體正常核型，1 號(hào)染色體長(zhǎng)臂有微小缺失，與 TK 基因定位區(qū)一致。
體外培養(yǎng)核心是 TK 缺陷導(dǎo)致的代謝特性。最適為含 10% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基（加非必需氨基酸），37℃、5% CO?環(huán)境下，傳代周期 72 小時(shí)，倍增時(shí)間 50 小時(shí)。因無法利用外源性胸苷合成 DNA，在 HAT 培養(yǎng)基中 48 小時(shí)全死亡，普通培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，導(dǎo)入 TK 基因的陽性細(xì)胞可在 HAT 中存活，篩選效率 10??。在含 BrdU 培養(yǎng)基中存活率 85%，遠(yuǎn)高于野生型的 10%，能規(guī)避嘧啶類似物毒性。
培養(yǎng)操作需注意貼壁依賴和代謝特點(diǎn)。傳代用 0.25%yi酶 - EDTA 消化 2-3 分鐘，傳代比例 1:3，凍存用含 10% DMSO 的wan全培養(yǎng)基，復(fù)蘇存活率超 90%。培養(yǎng)基需充足谷an酰胺（2mM）和葡萄糖（4.5g/L），pH 維持 7.2-7.4，酸性環(huán)境會(huì)抑制增殖。
輻射敏感性上，對(duì) X 射線和 γ 射線敏感度遠(yuǎn)超野生型，LD50 為 2Gy（野生型 4Gy），輻射后 DNA 損傷修復(fù)慢，G2/M 期阻滯率 60%，p53 表達(dá)增 5 倍，凋亡率 35%，是輻射防護(hù)劑和增敏劑篩選的理想模型。
基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中，它是驗(yàn)證 TK 基因功能的標(biāo)準(zhǔn)工具。導(dǎo)入小鼠 TK cDNA 后，陽性克隆在 HAT 中存活，TK 酶活性恢復(fù)至野生型 80%，嘧啶代謝正常，1?C - 胸苷摻入量從 0.1% 升至 90%。實(shí)驗(yàn)顯示 SV40 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) TK 表達(dá)效率是 β- 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的 3 倍，基因表達(dá)背景穩(wěn)定，重復(fù)性好。
嘧啶代謝研究中，其 DNA 合成的 dTTP 全靠從頭合成，被氨基蝶呤阻斷后 dTTP 耗盡致 DNA 復(fù)制停止。尿苷攝取速率是野生型 1.5 倍，谷an酰胺消耗增 20%，可作為胸苷酸合酶抑制劑研究模型，對(duì)氟尿*啶的 IC50 0.5μM，遠(yuǎn)低于野生型的 5μM。
生物制藥中，可生產(chǎn)重組蛋白，轉(zhuǎn)染人白細(xì)胞介素 - 2 基因后分泌量達(dá) 300IU/mL?24h，HAT 篩選獲穩(wěn)定表達(dá)株比例 5%，適合微載體培養(yǎng)，反應(yīng)器中細(xì)胞密度達(dá) 8×10?細(xì)胞 /mL。
輻射遺傳學(xué)上，染色體畸變率與輻射劑量線性相關(guān)（r=0.98），可作輻射劑量生物標(biāo)志物，與物理劑量計(jì)偏差＜10%，體外培養(yǎng)簡(jiǎn)便，能長(zhǎng)期保存用于回顧性劑量重建。
細(xì)胞毒性測(cè)試中，可評(píng)估嘧啶類似物特異性毒性，新型胸苷酸合酶抑制劑對(duì)其 IC50 0.3μM，對(duì) TK 陽性細(xì)胞 3μM，靶向性好，能減少藥物篩選假陽性。
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